- Размер праймера должен быть 16-25 нуклеотидов. Меньше 16-ти: слабая связь с целью
- Разница в температуре плавления праймеров - не более 6 градусов
- Ц+Г должно быть 50-60 %
- Для улучшения качества отжига рекомендуется подбирать праймеры так, чтобы последние несколько нуклеотидов 3' - конца праймера содержали GC-основания
- Проверь сбалансированность PCR по нуклеотидам и праймерам Расчёт параметров ПЦР
- Отсутствие внутренней вторичной структуры (праймеры не должны быть само- и взаимнокомплиментарными)
- Отсутствие комплементарности между 3'-концами (чтобы не образовывалось праймер-димеров)
- Оптимальная концентрация праймеров подбирается эмпирически, но не должна быть больше 50 пикомолей на пробирку - иначе начнётся неспецифический отжиг праймеров
- Упрощенный расчет оптимальной температуры отжига праймера:
Tm = [(A+T) x 2 °C] + [(G+C) x 4 °C](если суммарная длина олигонуклеотида не превышает 20 оснований)
Tm = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T))(если суммарная длина олигонуклеотида составляет 20-30 оснований)
- Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной, взятой в качестве критерия при выборе праймеров, специфичности. При попадании на такую зону, отжига праймеров происходить не будет, и как следствие - ложноотрицательный результат
